|
|
Directed evolution of enzymes on microfluidic chip
Kohúteková, Táňa ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Prokop,, Zbyněk (vedoucí práce)
This thesis focuses on the directed evolution of enzymes using Fluorescence–Activated Droplet Sorting (FADS) on a microfluidic chip. A new FADS system was constructed, validated for high-throughput optical detection of microfluidic droplets, and coupled with real-time dielectrophoretic sorting. The system was benchmarked using two different populations (DhaA31, ancHLD-RLuc) of Haloalkane dehalogenases (HLD) expressed in Escherichia coli cells and one population of empty pIDR9 vector in a ratio of 5:45:50, mimicking the protein library. The collected and analyzed sorting data show that the droplet intensities were recorded in the same proportion as the theoretical ratio. The library of HLD mutants with insertions and deletions was then sorted using the system to obtain 1 % of the variants with the highest activity and the results are reported. The FADS data analyzing system was programmed in LabVIEW bundled with Python, with functions for initial analysis, prediction of threshold voltage, validation and graphical interpretation of data, and final reporting of processes.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Engineering and selection of protein binders recognising medically important cytokines
Huličiak, Maroš ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Pichová, Iva (oponent) ; Kukačka, Zdeněk (oponent)
in Czech Proteinovému inženýrství se dostává čím dál tím více pozornosti jakožto užitečnému nástroji v oblasti biotechnologií a moderní medicíny. Malé, uměle vytvořené molekuly odvozené ze stabilních proteinů, tzv. skafoldů, jsou potenciální náhradou široce používaných protilátek. V této práci představuji využití dvou takovýchto skafoldů navržených v naší laboratoři pro vývoj stabilních vazebných proteinů s vysokou vazebnou afinitou i specifitou. Tato práce pojednává konkrétně o vývoji dvou vazebných molekul interagujících s lékařsky důležitými lidskými cytokiny a jejich buněčnými receptory - jmenovitě s interleukinem-10, receptorem interleukinu- 28 a alfa receptorem interleukinu-9. Rekombinantní cytokiny i oba receptory byly ve vysoké kvalitě a s vysokými výtěžky produkovány v eukaryotických buňkách a sloužily jako molekulární cíle pro selekci pomocí displejových metod řízené evoluce. Prokázali jsme, že aplikace ribozomálního a kvasinkového displeje, nebo jejich nekonvenční kombinace vede k úspěšnému generování vysoce afinitních a specifických vazebných molekul založených na nově navržených proteinových skafoldech nazvaných 57aBi a 57bBi.
|
|
|
Modulation of interactions of cytokines and their receptors
Kolářová, Lucie ; Schneider, Bohdan (vedoucí práce) ; Rozbeský, Daniel (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
(In Czech) Protein-proteinové interakce, stejně jako interakce s dalšími molekulami například DNA a RNA, hrají důležitou roli v široké škále biologických aktivit a procesů v živých buňkách. Pochopení proteinových interakcí, nové přístupy a nástroje pro modulaci těchto interakcí jsou důležité pro medicínskou a biotechnologickou oblast výzkumu a vývoje. Jako modelový systém pro studium biologických interakcí a modulaci biologických funkcí jsme využili interleukiny z rodiny 10. Podmínkou studia biologických procesů a pochopení biomolekulárních interakcí je příprava rekombinantních proteinů, které jsou stabilní v širokém spektru podmínek. Exprese rekombinantních proteinů v dostatečném množství a kvalitě je ale často náročným úkolem. Naším cílem bylo proto vytvořit nové přístupy k produkci složitých proteinů. V této práci popisujeme modifikaci interleukinu-24 (IL-24), člena skupiny IL-10 rodiny pomocí níž jsme dosáhli zvýšení exprese a stability IL-24. Práce ukazuje, že aplikace proteinového inženýrství je vhodným nástrojem pro studium složitých proteinů. V druhé části této práce jsme se zaměřili na nové postupy v přípravě malých vazebných proteinů (skafoldů). Malé vazebné proteiny se staly ve vývoji proteinových léčiv slibnou alternativou k široce využívaným protilátkám. Nové vazebné proteiny se...
|
|
|
Konstrukce mutantních enzymů pro degradaci antropogenních polutantů
Kratochvíl, Jakub
Enzymy jsou přírodní katalyzátory obrovské škály chemických reakcí a jsou vyhledávány jako ekologičtější a ekonomicky méně nákladné alternativy k běžným katalyzátorům používaným v průmyslových odvětvích od bioremediací až po aplikace v lékařství a farmacii. Mezi takovéto enzymy patří i halogenalkandehalogenázy, které katalyzují hydrolýzu halogenovaných sloučenin na odpovídající alkoholy, halogenidové ionty a protony. Přirozeně se vyskytující halogenalkandehalogenázy však mají funkční omezení a pro průmyslové aplikace nejsou dosud vhodné. Zde se dostávají ke slovu metody řízené evoluce nebo racionálního designu jako efektivní strategie pro vytváření ge-netické rozmanitosti a získání nových variant enzymů s požadovanými vlastnostmi. V této práci byla metodami proteinového inženýrství modifikována halogenalkandehalogenáza DhaA31 s cílem vylepšit její katalytické parametry vůči antropogennímu polutantu 1,2,3-trichlorpropanu.Právní doložka:Prosím o odložení zveřejnění materiálů a metod, výsledků a závěrů diplomové práce na dobu 3 let. Tyto výsledky jsou součástí projektu, který ještě nebyl publikován.
|
host ::
RSS.